1. Popis keratinu

Keratin je vysoce mechanicky odolná a chemicky nereaktivní makromolekulární bílkovina, která se vyskytuje u všech savců.

Keratin je nerozpustný ve vodě, nerozpustný ve slabých kyselinách a slabých zásadách a také se špatně rozpouští v polárních organických rozpouštědlech.

Keratin je vysoce odolný proti enzymové degradaci (nejčastěji pepsinu a trypsinu).  Degradaci brání vzájemné spletení keratinových helixů pomocí disulfidických vazeb mezi cysteiny a také vodíkové vazby, vázající jednotlivá keratinová vlákna k sobě.

Keratin je základní stavební látkou všech vyšších obratlovců a řadí se mezi fibrilární proteiny a skleroproteiny. Proto keratin plní nejčastěji častěji funkci krycí a mechanickou. Jeho výskyt je tedy nejčastěji u míst se zvýšenou zátěží, kde je potřeba zpevnění.

Velmi často jej nalezneme v epiteliální tkáni a v buňkách kde tvoří součást intermediálních filamentů. Intermediální filamenty jsou jedny z nejpevněji uspořádaných vláken v organismech. Tyto keratinové mikrofilamenty tvoří základ mikrotubulů. Mikrotubuly jsou silné, vláknité struktury v nacházející se v cytoskeletu. Zajišťují transport organel v buňce.

U vyšších živočichů jej nalezneme například v rozích, nehtech, chlupech, vlně, nebo vlasech.

U ostatních živočichů, jako například plazů, ptáků či obojživelníků nalezneme keratin ve vnější vrstvě pokrývající tělo, drápy nebo peří. (Schor a Krimm, 1961).

2. Primární struktura

Primární struktura keratinu je tvořena aminokyselinami spojenými peptidickou vazbou navzájem o obecném vzorci uvedeném na obrázku č. 1

Obrázek 1 – Primární struktura keratinu

V keratinu je pravidelný výskyt cysteinu. Tyto sirné aminokyselinové jednotky slouží k vzájemnému sesíťování za tvorby disulfidických můstků.  Zvýšené množství cysteinu, které se vyskytuje v hojné míře u vyšších organismů, odlišuje keratin od elastinů nebo kolagenů.

Vzhledem k tomu, že stabilita keratinu je dána množstvím sirných aminokyselin, tak můžeme dělit keratin dle jeho množství:

Měkký keratin – keratin obsahující maximálně 2% sirné složky

Tvrdý keratin –  keratin obsahující až 22% sirné složky

Měkký keratin

Je jej snažší degradovat. Nachází se především ve spodní vrstvě epidermis a také ve vlasovém jádru.  Sirné složky jsou u něj slabě provázané.

Tvrdý keratin

Takový druh keratinu má vysokou odolnost vůči chemickým faktorům a nalezneme jej nejvíce v nehtech, rozích a vlasech. Další je výrazný a pravidelný výskyt aminokyseliny serinu. Tato aminokyselin je zodpovědná za tvorbu vodíkových vazeb a podílí se podobně jako cystein na tvorbě sekundární struktury. Pro keratin je také charakteristické zvýšené množství glycinu a prolinu a snížené množství lysinu, histidinu a metioninu.

Prolin je aminokyselina, která si zaslouží svoji pozornost z toho důvodu, že udává keratinu jeho sekundární strukturu (Schor a Krimm 1961). Bylo zjištěno, že se v keratinu vyskytuje v proměnlivém množství od 8% – 12% a je zodpovědný za pravotočivé keratinové vinutí. Pro lepší představu o zastoupení aminokyselin v peří zde udávám tabulku I, kde je celkové shrnutí množství aminokyselin v peří:

Tabulka I– Zastoupení jednotlivých aminokyselin v keratinu (Mukesh a kol, 2012).

Aminokyselina	Množství aminokyselin v peří [gak/ kgproteinu]
Alanin	56,6
Arginin	67,4
Aspartát	68,0
Cystein	46,1
Glutamát	102,5
Glycin	76,6
Histidin	14,4
Isoleucin	49,2
Leucin	84,3
Lysin	22,3
Methionin	6,4
Fenylalanin	52,2
Prolin	90,8
Serin	114,4
Threonin	48,9
Tyrosin	24,1
Valin	76,1

 

3. Sekundární struktura

Sekundární struktura keratinu je dána především jeho aminokyselinovým složením.

Vyskytují se celkem čtyři prostorové konformace

• α keratin
• β keratin
• γ keratin
• Amorfní keratin

Nejčastěji se setkáváme s α keratinem. Tato konformace obsahuje pravotočivé α helikální uspořádání v prostoru. Takové uspořádání má průměrnou molární hmotnost kolem 60-80 kDa. Na jednu helixovou otáčky je potřeba 64 aminokyselinových residuí a délka 189 Å  (Schor a Krimm 1961). Nejčastěji se nachází u savců.

β keratin je struktura uspořádaná do tvaru β skládaného listu. Nejhojnější je jeho výskyt tam, kde je potřeba chránit kutikulu. β keratiny je těžké extrahovat ze vzorků. Nejčastěji se nachází u plazů a ptáků.

γ keratin je keratin globulárního tvaru s vysokým obsahem sirných složek a o nižší molekulární hmotnosti, typicky kolem 15 kDa.

Veškeré další struktury keratinu nevykazující žádnou pravidelnost klasifikujeme jako amorfní keratin

4. Terciární struktura

Terciární struktura keratinu je tvořena z tří pravotočivých α helixů, které tvoří jeden levotočivý superhelix. Na terciární struktuře se podílí i sesíťování přes disulfidické můstky

Čtyři takové superhelixy stočené navzájem tvoří  protofibrilu, která je základní jednotkou mikrofibril. Dvě mikrofibrily uprostřed a sedm mikrofibril kolem nich tvoří útvar zvaný makrofibrila. Tento útvar je již pozorovatelný světelným mikroskopem. Celý komplex je stabilizován již dříve zmíněnými disulfidickými vazbami a také vodíkovými můstky (Korniłłowicz-Kowalska a Bohacz 2011). Obrázek 2 přejatý z publikace shrnuje jednotlivé strukturní úrovně keratinu.

Obrázek 2 – Popis jednotlivých strukturních úrovní keratinu (Korniłłowicz-Kowalska a Bohacz  2011).

I. Využití odpadních materiálů s výskytem keratinu

Každý den je v důsledku konzumace kuřat lidmi vyprodukováno obrovské množství odpadního peří. Jeho pálení je nejen neekonomické, ale také není využito naplno skrytého potenciálu, který v tomto materiálu dřímá. Jen v USA je vyprodukováno asi 815 milión kg peří ročně (Ichida a Krizova 2001). Například v Polsku je ročně vyprodukováno 77 000 tun peří z brojlerů (Korniłłowicz-Kowalska a Bohacz 2011).  Peří na kuřatech tvoří okolo 5% – 7%  hmotnosti. Tedy z 50 000 kusů drůbeže, je možné získat v průměru okolo 2 – 3 tuny peří (Dalev, 1994)., což je dostatečné množství, u kterého má význam se zabývat užitečnějším způsobem zpracování.

3. Využití keratinu jako krmiva

Jako zajímavé se jeví užití hydrolyzátu z peří získaného působením alkalické proteinázy na peří v zásaditých podmínkách. Takový hydrolyzát obsahuje aminokyseliny ve stravitelné formě.

Roku 1971 byla provedena první pilotní studie (Elmayergi a Smith, 1971)., která ukázala, jak je možné krmit pomocí peří slepice. Studie také ukázali ve své pilotní práci význam nutriční hodnoty v peří při zakrmování slepic. Hydrolyzát z peří byl fermentován bakteriemi kmene Streptomyces fradiae a slepice byly následně tímto hydrolyzátem zakrmovány. Výsledky změny váhy slepic jsou shrnuté v tabulce IV.

Tabulka IV – Zakrmování slepic pomocí hydrolyzátu peří získaného fermentací pomocí Streptomyces fradie

Zakrmovací směs	Změna váhy slepice [g]	Množství zkrmené směsi [g]
Sója	59,0 ± 4,7	166,3 ± 14,2
Nefermentované peří	-7 ± 0	76,3 ± 8,1
Nefermentované peří s přídavkem esenciálních ak	-12,2 ± 2,9	170,0 ± 8,9
Nefermentované peří s přídavkem esenciálních ak bez methioninu	-10,0 ± 1,6	71,3 ± 4,9
Nefermentované peří s přídavkem esenciálních ak bez lysinu	2,7 ± 2,5	90,7 ± 10,2
fermentované peří	20,3 ± 4,0	59,7 ± 7,5
Fermentované peří s přídavkem esenciálních ak	68,4 ± 1,5	165,7 ± 9,8
Fermentované peří s přídavkem esenciálních ak bez methioninu	19,0 ± 2,4	55, 0 ± 7,8
Fermentované peří s přídavkem esenciálních ak bez lysinu	15,3 ± 4,6	70,3 ± 12,8

Zakrmování slepic pomocí hydrolyzátu peří získaného fermentací pomocí Streptomyces fradie. Jako standard byl zvolen hydrolyzát ze sóje a nefermentovaný vzorek.  K fermentovaným vzorkům byly přidány esenciální aminokyseliny, methioninanebo lysin.

Z výsledků je patrné, že po fermentaci došlo ke zvýšení krmné hodnoty fermentované směsi, avšak nutriční hodnota krmné směsi se nijak nezvýšila a to pravděpodobně z důvodu nepřijatelnosti směsi pro slepice ve formě v jaké byla získána po fermentaci.

V dalších experimentu byla zakrmována kuřata po dobu tří týdnů stejným množstvím různé potravy. Kuřata se nechala tři dny vyhladovět a poté se zakrmovala. Jako kontrola bylo zvoleno zakrmování pomocí sojových bobů. V druhém případě byla kuřata zakrmena keratinovou moučkou a třetí skupina byla zakrmena keratinovou moučkou, kde byla přidána keratináza z Bacillus licheniformis PWD-1.

Tabulka č. V udává výsledky změny hmotnosti u jednotlivých skupin kuřat:

Tabulka V – výsledky zakrmování mladých kuřat (patent č. 5186961)

Skupina	1	2	3
Potrava	Sójové boby	Keratinová moučka z peří	Keratinová moučka z peří s keratinázou
Změna hmotnost[g/den]	66	50	56

 

V studii experimentální studii z roku 2009 (Seo a kol, 2009) byla zakrmována prasata po dobu 11 týdnů pomocí moučky z peří, která byla připravena degradací keratinu za vysokého tlaku a varu. Jako kontrola byla zvolena směs kukuřice a soji. Výsledky jsou shrnuté v tabulce číslo VI.

Tabulka VI – Výsledky zakrmování prasat moučkou z peří (Seo a kol, 2009)

Fáze	Kontrola [gzkonzumovaného/gpříbytku hmnotnosti]	3% moučka z peří [gzkonzumovaného/gpříbytku hmnotnosti]	6% moučka z peří [gzkonzumovaného/gpříbytku hmnotnosti]
0-3 týden	2,48	2,41	2,45
3-8 týden	2,81	3,14	3,00
8-11 týden	3,02	3,16	3,24
10-11 týden	2,80	2,95	2,93

 

Z výsledků je patrné, že při obohacení krmiva moučkou peří došlo k mírnému nárůstu hmotnosti.  Další využití keratinu nalezneme v kosmetickém průmyslu, kde se přidává do šampónů pro zesílení vlasů, krémů na pleť, různým mazacím olejům nebo krémům

II. Způsoby hydrolýzy peří

Keratin může být degradován velmi efektivně tehdy, jsou – li přerušeny jeho disulfidické můstky pomocí redukčních činidel jako je CuSO₄, merkaptoacetát jodooctová kyselina, sulfid sodný nebo tetrathionát sodný. První problém je ten, že taková masová redukce není možná v průmyslovém měřítku z důvodu vysokých nákladů a také z toho důvodu, že by meziprodukt bylo obtížné zpracovávat například pomocí mikroorganismů, poněvadž pro většinu jsou redukční činidla toxická.

Druhým problémem je fakt, že redukční agens jsou jedovaté a proto by výslednou látku nebylo možné použít ani jako krmnou směs.

1. Fyzikální degradace

Hydrotermální degradace je způsob degradace keratinázy za vysokého tlaku a působení vodní páry. Tato metoda je vhodná pro rozklad peří, jenže ve využitelnosti se neosvědčila nejen z důvodu vysokých energetických nákladů, ale také proto, že se při degradaci za těchto podmínek ničí aminokyseliny jako je metionin, lysin nebo tryptofan a vznikají nežádoucí aminokyseliny jako je lysoalanin nebo lanthothion. Tyto vedlejší produkty snižují nutriční hodnotu výsledné směsi.

2. Chemická degradace

U chemické degradace se používá nejčastěji hydrolýzy vazeb ve vyšších nebo extrémních pH. Je možné vazby hydrolyzovat v kyselém prostředí pomocí HCl za zvýšené teploty tak, jak tomu bylo dříve například u výroby různých dochucovadel potravin. Tento způsob je možné užít pro degradaci keratinu, avšak není příliš efektivní. Při kyselé hydrolýze keratinu dochází k destrukci významných aminokyselin v důsledku nutnosti užití vyšších koncentrací kyseliny, aby bylo dosaženo degradačních podmínek. Druhý ze způsobů degradace je v zásaditém prostředí pomocí hydroxidů případně spolu i za zvýšeného tlaku nebo teploty. Alkalické prostředí a zvýšený tlak jsou faktory, které vhodně působí na rozrušení disulfidických a peptidických vazeb v keratinu a tím dochází k jeho degradaci.  Bohužel se tento tradiční způsob degradace keratinu neprosadil v širším měřítku a to z toho důvodu, že je potřeba velké množství energie pro samotnou degradaci keratinu a nezřídka v takových extrémních podmínkách dochází k  likvidaci nutričně hodnotných aminokyselin jako je lysin, histidin nebo metionin za vzniku lysoalaninu, lanthothionu a dalších.

3. Enzymová degradace

Enzymová degradace se jeví jako rozumná alternativa k chemickým degradacím a to především z důvodu potřeby nižších teplot a také z důvodu nižší spotřeby chemikálií.  Většina enzymů užívaných v pracích prášcích je modifikovaná tak, aby působila v zásaditém prostředí a o zvýšených teplotách.

Alkaláza (National center for biotechnology education, 2013) je komerčně vyráběný enzym produkovaný bakteriemi Bacillus licheniformis. Alkaláza je endo-peptidáza, která má charakter serinové proteázy mající velmi široké spektrum substrátové specifity. Její pH optimum je v rozmezí od 6,5 – 8,5 a teplotní optimum je v rozmezí od 45°C do 65 °C. Maximální aktivitu má při 60°C. Její cena je v přepočtu přibližně 350 kč za 100 ml

Savináza  (National centre for biotechnolgy education, 2013) je komerčně vyráběný enzym produkovaný bakteriemi rodu Bacillus, například Bacillus lentus. Savináza je endo-peptidáza, která má charakter serinové proteázy mající velmi široké spektrum substrátové specifity. Její pH optimum je v rozmezí od 8 – 12 a teplotní optimum je v rozmezí od 20°C do 60 °C. Maximální aktivitu má při 55°C. Její cena je v přepočtu přibližně 350 kč za 100 ml

Další zajímavý enzym, který by bylo možné použít k degradaci keratinu namísto keratinázy je například Esperáza, která je produkována nejčastěji bakteriemi rodu Bacillus.

Nevýhodou použití samotné enzymové degradace je ten fakt, že keratin je příliš silně zpevněn disulfidickými můstky a bez rozbití těchto vazeb nejsou enzymy schopny v dostatečném měřítku degradovat keratin za kratší dobu a proto je potřeba surový keratin před působením enzymům předpřipravit.

4. Enzymově – chemická metoda

500 g peří bylo v prvním kroku povařeno 30 min při spolu s 1 litrem 0,3M NaOH za zvýšené teploty (180°C), následně byla teplota snížena a do reakční směsi bylo přidáno 1,25g alkalické proteinázy. Hydrolýza vazeb probíhala po dobu 2 hodin a poté byla proteináza inaktivovaná zvýšeným varem. Z 500 g zpracovaného peří byla po vysušení výstupem směs o šedé, práškové konzistenci s hustotou 0,332 g/cm³ a o hmotnosti 19,0001 g. Směs měla slanou chuť a charakteristický zápach (Mukesh a kol, 2012). Výsledná směs byla zanalyzována a výsledek byl porovnán s aminokyselinovým zastoupením ve zpracovaném peří, které bylo degradováno pomocí 6M HCl po dobu 24 hodin při teplotě 110°C.  V následující tabulce V. je udáno zastoupení jednotlivých aminokyselin.

Tabulka V – Jednotlivé zastoupení aminokyselin před hydrolýzou a po hydrolýze. Udáno v jednotkách g_AMK/kg_peří  (Mukesh a kol, 2012).

Aminokyselina	Množství aminokyselin v hydrolyzátu [gAMK/kgpeří]	Množství aminokyselin v peří degradovaném v HCl [gAMK/kgpeří]
Alanin	55,6	58,9
Arginin	70,1	67,7
Cystein	42,4	44,7
Glutamát	102,8	101,5
Glycin	76,9	76,5
Histidin	13,7	14,1
Izoleucin	51,5	49,1
Valin	69,9	74,1
Leucin	86,1	84,2
Lysin	23,7	22,1
Fenylalanin	50,5	52,1
Prolin	89,2	90,5
Serin	112,5	114,2
Treonin	44,5	48,7
Tyrozin	24,5	24,2

Z tabulky číslo V.  je patrné, že aminokyselinové zastoupení je stabilní a tudíž nedochází ke ztrátě nutriční hodnoty peří. Hlavní rozdíl je v konzistenci. Jednotlivé parametry, shrnuté v tabulce VI.  byly analyzovány a porovnány. Množství vody bylo měřeno po 3 hodinách sušení při teplotě 105°C. Množství vlákna bylo měřeno pomocí extrakce v 2% H₂SO₄ a 2°% KOH při 100°C po dobu 15 minut. Množství vlákna bylo měřeno pomocí extrakce v etheru. Množství popelu bylo zváženo po spálení materiálu při 550 – 600 °C po dobu 3 hodin. Množství minerálů bylo analyzováno po rozložení výchozích materiálu pomocí HNO₃ HClO₄  Argonovou emisní spektrometrií.

 

Tabulka VI- Porovnání zastoupení množství komponent v surovém peří a ve zreagované a vysušené směsi Udáno v jednotkách mg AMK/ g peří (Mukesh a kol, 2012).

Složení	Množství komponent ve vysušeném hydrolyzátu z peří [mg / g sušiny]	Množství komponent v peří [mg / g sušiny]
Voda	51	494
Surová bílkovina	91	890
Vlákno	6,4	0
Tuk	13,2	14,3
Popel	85,2	62,1
Vápník	3,2	3,4
Fosfor	0,9	1,1
Sodík	14,4	4,6
Chloridové ionty	20,7	7,6

Z výsledku tabulky VI je patrno, že hlavní rozdíl je ve formě, v jaké se aminokyseliny vyskytují. Ve formě hydrolyzátu z peří se jeví jako velmi zajímavá alternativa pro zakrmování drůbeže z důvodu její vhodné stravitelnosti pro drůbež.  Při porovnání výsledků byl nalezen nesoulad se získanými výsledky analýzy tabulky č. VI. Dle publikace od Daleva  (1994) je množství surové bílkoviny 894,4 mg/g, avšak dle publikace od Kumara (2012) je množství surové bílkoviny 91 mg/g. Tento nesoulad by bylo vhodné experimentálně ověřit.

III. Použitá literatura

Avasn M., Aruna L., Ramakrishna R., Apta C. (2011) Degradation of feather and hair by Chrysosporium tropicum: A potent keratinophilic fungus. African Journal of Biotechnology, 10, str. 3579-3584.

Burtt E., Ichida J. (1999) Occurence of feather degrading bacilli in the plumage of birds. The Auk, 116, str. 364 – 372.

Coward-Kelly G., Chang V., Agbogbo F., Holtzapple H. (2006) Lime treatment of keratinous materials for the generation. Bioresource technology, 97 , str. 1337-1347.

Dalev P. (1994). Utilization of waste feathers from poultry slaughter for production of a protein concentrate. Bioresource technology ,45, str. 265 – 267.

Deivasigamani B., Alagappan, M. (2008). Industrial application of keratinase and soluble proteins from feather keratins. Journal of enviromental biology , str. 933 – 936.

Elmayergi H., Smith R. (1971). Influence of growth of Sreptomyces fradiae on pepsin-HC1 digestibility of feather meal, Journal of Microbiology, str. 1067-1072

Hill P. (2010). Some properties of keratin biomaterials: Kerateines. Biomaterials, str. 585-593.

Ichida J., Krizova L. (2001). Bacterial inoculum enhances keratin degradation and biofilm formulation in poultry compost. Journal of microbiological methods , str. 199-208.

Korniłłowicz-Kowalska T., Bohacz J. (2011). Biodegradation of keratin waste: Theory and practical aspects. Waste Management,31, str. 1689–1701.

Lin X. (1992). Purification and characterization of a keratinase from a feather degrading Bacillus licheniformis strain. Appl.Environ. Microbiol (58), str. 3271-3275.

Maruthi A. (2011). Degradation of feather and hair by Chrysosporium tropicum. A potent keratinophilic fungus. African Journal of Biotechnology,10, str. 3579 – 3584.

Mukesh K., Lavanya P.,Immaculate R.,Balakumaran D., Kalaichelvan P. (2012) Production of Feather Protein Concentrate from Feathers by In vitro Enzymatic Treatment, its Biochemical Characterization and Antioxidant. Nature, Middle-East journal of Scientific research, 11, str. 881-886.

Novoeznyme – Savinase [online]. Datum aktualizace 16. 01. 2013, :[ 16. 01. 2013] Dostupné z http://www.ncbe.reading.ac.uk/ncbe/materials/enzymes/savinase.html)

Onifade A., Al-Sane N., Al-Musallam A., Al Zarban S (1998) Review: Potentials for biotechnological applications of jeratin-degrading microorganisms and their enzymes for nutritional improvement of feathers and other keratins as livestock feed resources. Bioresource technology, 66, str. 1-11.

Patent č. 5186961: method and composition for maintainning animals on a keratin-containing diet, 1993-02-16.

Protease – novoenzyme Alcalase [online]. Datum aktualizace 16. 01. 2013, :[ 16. 01. 2013] Dostupné z http://www.ncbe.reading.ac.uk/ncbe/materials/enzymes/alcalase.html

Rogers G., Kemp J. (1972) Differentiation of Avian Keratinocytes. Characterization and relationships of the Keratin proteins of adult embrionic feathers and scales. Biochemistry, 11, str. 969-975.

Seo S., Jung  B., Lee M., Paik K. (2009) The Effect of Dietary Supplementation of Feather Meal on the Performance and Muscular Taurine Contents in Growing-finishing pigs, Asian-Aust. J. Anim. Sci., 22, str. 1407 – 1413

 

Sharma, Mu., Sharma Me., Rao V. (2011) In vitro biodegradation of keratin by dermatophytes and some soil keratinophiles. African Journal of Biochemistry Research, 5, str. 1 – 6.

Schor R., Krimm S. (1961). Studies on the structure of feather keratin. Biophysical Journal, 1, str. 489-515.

Wrześniewska-Tosik R., Janusz A. (2007) Biocomposites with a content of keratin from chicken feathers. fibres & textiles in Eastern Europe ,15, str. 106-112.

Xing Z. (2011) Keratin Nanofibers as a Biomaterial. International Conference on Nanotechnology and Biosensors, (stránky 120 – 124). Singapore.