Tato rešeršní práce je jen velmi krátký a stručný výňatek toho, co mě zaměstnávalo posledních pár týdnů. Pokusil jsem se shrnout dosavadní poznatky o keratinu a informace o možnostech využití jeho hydrolyzátu k obohacení krmné biomasy pro chovnou zvěř. Bohužel při hledání informací jsem zjistil, že na českém internetu je výrazný deficit komplexního poznání o keratinu a proto se jej pokusím alespoň částečně doplnit. Celé psaní je jen výňatek z několika přečtených publikací a má charakter rešeršní práce. Věřím, že se to jednou za čas může někomu hodit a proto to nechávám zde na svém blogu uloženo. Až jednoho dne nebudu mít co dělat, vložím to na českou wikipedii:-)

✨ 1. Popis keratinu¶

Keratin je vysoce mechanicky odolná a chemicky nereaktivní makromolekulární bílkovina, která se vyskytuje u všech savců.

Keratin je nerozpustný ve vodě, nerozpustný ve slabých kyselinách a slabých zásadách a také se špatně rozpouští v polárních organických rozpouštědlech.

Keratin je vysoce odolný proti enzymové degradaci (nejčastěji pepsinu a trypsinu). Degradaci brání vzájemné spletení keratinových helixů pomocí disulfidických vazeb mezi cysteiny a také vodíkové vazby, vázající jednotlivá keratinová vlákna k sobě.

Keratin je základní stavební látkou všech vyšších obratlovců a řadí se mezi fibrilární proteiny a skleroproteiny. Proto keratin plní nejčastěji častěji funkci krycí a mechanickou. Jeho výskyt je tedy nejčastěji u míst se zvýšenou zátěží, kde je potřeba zpevnění.

Velmi často jej nalezneme v epiteliální tkáni a v buňkách kde tvoří součást intermediálních filamentů. Intermediální filamenty jsou jedny z nejpevněji uspořádaných vláken v organismech. Tyto keratinové mikrofilamenty tvoří základ mikrotubulů. Mikrotubuly jsou silné, vláknité struktury v nacházející se v cytoskeletu. Zajišťují transport organel v buňce.

U vyšších živočichů jej nalezneme například v rozích, nehtech, chlupech, vlně, nebo vlasech.

U ostatních živočichů, jako například plazů, ptáků či obojživelníků nalezneme keratin ve vnější vrstvě pokrývající tělo, drápy nebo peří. (Schor a Krimm, 1961).

✨ 2. Primární struktura¶

Primární struktura keratinu je tvořena aminokyselinami spojenými peptidickou vazbou navzájem o obecném vzorci uvedeném na obrázku č. 1

📷 Obrázek 1 – Primární struktura keratinu¶

V keratinu je pravidelný výskyt cysteinu. Tyto sirné aminokyselinové jednotky slouží k vzájemnému sesíťování za tvorby disulfidických můstků. Zvýšené množství cysteinu, které se vyskytuje v hojné míře u vyšších organismů, odlišuje keratin od elastinů nebo kolagenů.

Vzhledem k tomu, že stabilita keratinu je dána množstvím sirných aminokyselin, tak můžeme dělit keratin dle jeho množství:

Měkký keratin - keratin obsahující maximálně 2% sirné složky

Tvrdý keratin - keratin obsahující až 22% sirné složky

✨ 🧬 Měkký keratin¶

Je jej snažší degradovat. Nachází se především ve spodní vrstvě epidermis a také ve vlasovém jádru. Sirné složky jsou u něj slabě provázané.

✨ 🧬 Tvrdý keratin¶

Takový druh keratinu má vysokou odolnost vůči chemickým faktorům a nalezneme jej nejvíce v nehtech, rozích a vlasech. Další je výrazný a pravidelný výskyt aminokyseliny serinu. Tato aminokyselin je zodpovědná za tvorbu vodíkových vazeb a podílí se podobně jako cystein na tvorbě sekundární struktury. Pro keratin je také charakteristické zvýšené množství glycinu a prolinu a snížené množství lysinu, histidinu a metioninu.

Prolin je aminokyselina, která si zaslouží svoji pozornost z toho důvodu, že udává keratinu jeho sekundární strukturu (Schor a Krimm 1961). Bylo zjištěno, že se v keratinu vyskytuje v proměnlivém množství od 8% - 12% a je zodpovědný za pravotočivé keratinové vinutí. Pro lepší představu o zastoupení aminokyselin v peří zde udávám tabulku I, kde je celkové shrnutí množství aminokyselin v peří:

Tabulka I– Zastoupení jednotlivých aminokyselin v keratinu (Mukesh a kol, 2012).

✨ 3. Sekundární struktura¶

Sekundární struktura keratinu je dána především jeho aminokyselinovým složením.

✨ Vyskytují se celkem čtyři prostorové konformace¶

• α keratin
• β keratin
• γ keratin
• Amorfní keratin

Nejčastěji se setkáváme s α keratinem. Tato konformace obsahuje pravotočivé α helikální uspořádání v prostoru. Takové uspořádání má průměrnou molární hmotnost kolem 60-80 kDa. Na jednu helixovou otáčky je potřeba 64 aminokyselinových residuí a délka 189 Å (Schor a Krimm 1961). Nejčastěji se nachází u savců.

β keratin je struktura uspořádaná do tvaru β skládaného listu. Nejhojnější je jeho výskyt tam, kde je potřeba chránit kutikulu. β keratiny je těžké extrahovat ze vzorků. Nejčastěji se nachází u plazů a ptáků.

γ keratin je keratin globulárního tvaru s vysokým obsahem sirných složek a o nižší molekulární hmotnosti, typicky kolem 15 kDa.

Veškeré další struktury keratinu nevykazující žádnou pravidelnost klasifikujeme jako amorfní keratin

✨ 4. Terciární struktura¶

Terciární struktura keratinu je tvořena z tří pravotočivých α helixů, které tvoří jeden levotočivý superhelix. Na terciární struktuře se podílí i sesíťování přes disulfidické můstky

Čtyři takové superhelixy stočené navzájem tvoří protofibrilu, která je základní jednotkou mikrofibril. Dvě mikrofibrily uprostřed a sedm mikrofibril kolem nich tvoří útvar zvaný makrofibrila. Tento útvar je již pozorovatelný světelným mikroskopem. Celý komplex je stabilizován již dříve zmíněnými disulfidickými vazbami a také vodíkovými můstky (Korniłłowicz-Kowalska a Bohacz 2011). Obrázek 2 přejatý z publikace shrnuje jednotlivé strukturní úrovně keratinu.

Obrázek 2 - Popis jednotlivých strukturních úrovní keratinu (Korniłłowicz-Kowalska a Bohacz 2011).

I. Využití odpadních materiálů s výskytem keratinu¶

Každý den je v důsledku konzumace kuřat lidmi vyprodukováno obrovské množství odpadního peří. Jeho pálení je nejen neekonomické, ale také není využito naplno skrytého potenciálu, který v tomto materiálu dřímá. Jen v USA je vyprodukováno asi 815 milión kg peří ročně (Ichida a Krizova 2001). Například v Polsku je ročně vyprodukováno 77 000 tun peří z brojlerů (Korniłłowicz-Kowalska a Bohacz 2011). Peří na kuřatech tvoří okolo 5% - 7% hmotnosti. Tedy z 50 000 kusů drůbeže, je možné získat v průměru okolo 2 – 3 tuny peří (Dalev, 1994)., což je dostatečné množství, u kterého má význam se zabývat užitečnějším způsobem zpracování.

🔍 3. Využití keratinu jako krmiva¶

Jako zajímavé se jeví užití hydrolyzátu z peří získaného působením alkalické proteinázy na peří v zásaditých podmínkách. Takový hydrolyzát obsahuje aminokyseliny ve stravitelné formě.

Roku 1971 byla provedena první pilotní studie (Elmayergi a Smith, 1971)., která ukázala, jak je možné krmit pomocí peří slepice. Studie také ukázali ve své pilotní práci význam nutriční hodnoty v peří při zakrmování slepic. Hydrolyzát z peří byl fermentován bakteriemi kmene Streptomyces fradiae a slepice byly následně tímto hydrolyzátem zakrmovány. Výsledky změny váhy slepic jsou shrnuté v tabulce IV.

Tabulka IV - Zakrmování slepic pomocí hydrolyzátu peří získaného fermentací pomocí Streptomyces fradie

Zakrmování slepic pomocí hydrolyzátu peří získaného fermentací pomocí Streptomyces fradie. Jako standard byl zvolen hydrolyzát ze sóje a nefermentovaný vzorek. K fermentovaným vzorkům byly přidány esenciální aminokyseliny, methioninanebo lysin.

Z výsledků je patrné, že po fermentaci došlo ke zvýšení krmné hodnoty fermentované směsi, avšak nutriční hodnota krmné směsi se nijak nezvýšila a to pravděpodobně z důvodu nepřijatelnosti směsi pro slepice ve formě v jaké byla získána po fermentaci.

V dalších experimentu byla zakrmována kuřata po dobu tří týdnů stejným množstvím různé potravy. Kuřata se nechala tři dny vyhladovět a poté se zakrmovala. Jako kontrola bylo zvoleno zakrmování pomocí sojových bobů. V druhém případě byla kuřata zakrmena keratinovou moučkou a třetí skupina byla zakrmena keratinovou moučkou, kde byla přidána keratináza z Bacillus licheniformis PWD-1.

Tabulka č. V udává výsledky změny hmotnosti u jednotlivých skupin kuřat:

Tabulka V - výsledky zakrmování mladých kuřat (patent č. 5186961)

V studii experimentální studii z roku 2009 (Seo a kol, 2009) byla zakrmována prasata po dobu 11 týdnů pomocí moučky z peří, která byla připravena degradací keratinu za vysokého tlaku a varu. Jako kontrola byla zvolena směs kukuřice a soji. Výsledky jsou shrnuté v tabulce číslo VI.

Tabulka VI - Výsledky zakrmování prasat moučkou z peří (Seo a kol, 2009)

Z výsledků je patrné, že při obohacení krmiva moučkou peří došlo k mírnému nárůstu hmotnosti. Další využití keratinu nalezneme v kosmetickém průmyslu, kde se přidává do šampónů pro zesílení vlasů, krémů na pleť, různým mazacím olejům nebo krémům

II. Způsoby hydrolýzy peří¶

Keratin může být degradován velmi efektivně tehdy, jsou - li přerušeny jeho disulfidické můstky pomocí redukčních činidel jako je CuSO4, merkaptoacetát jodooctová kyselina, sulfid sodný nebo tetrathionát sodný. První problém je ten, že taková masová redukce není možná v průmyslovém měřítku z důvodu vysokých nákladů a také z toho důvodu, že by meziprodukt bylo obtížné zpracovávat například pomocí mikroorganismů, poněvadž pro většinu jsou redukční činidla toxická.

Druhým problémem je fakt, že redukční agens jsou jedovaté a proto by výslednou látku nebylo možné použít ani jako krmnou směs.

✨ 1. Fyzikální degradace¶

Hydrotermální degradace je způsob degradace keratinázy za vysokého tlaku a působení vodní páry. Tato metoda je vhodná pro rozklad peří, jenže ve využitelnosti se neosvědčila nejen z důvodu vysokých energetických nákladů, ale také proto, že se při degradaci za těchto podmínek ničí aminokyseliny jako je metionin, lysin nebo tryptofan a vznikají nežádoucí aminokyseliny jako je lysoalanin nebo lanthothion. Tyto vedlejší produkty snižují nutriční hodnotu výsledné směsi.

✨ 2. Chemická degradace¶

U chemické degradace se používá nejčastěji hydrolýzy vazeb ve vyšších nebo extrémních pH. Je možné vazby hydrolyzovat v kyselém prostředí pomocí HCl za zvýšené teploty tak, jak tomu bylo dříve například u výroby různých dochucovadel potravin. Tento způsob je možné užít pro degradaci keratinu, avšak není příliš efektivní. Při kyselé hydrolýze keratinu dochází k destrukci významných aminokyselin v důsledku nutnosti užití vyšších koncentrací kyseliny, aby bylo dosaženo degradačních podmínek. Druhý ze způsobů degradace je v zásaditém prostředí pomocí hydroxidů případně spolu i za zvýšeného tlaku nebo teploty. Alkalické prostředí a zvýšený tlak jsou faktory, které vhodně působí na rozrušení disulfidických a peptidických vazeb v keratinu a tím dochází k jeho degradaci. Bohužel se tento tradiční způsob degradace keratinu neprosadil v širším měřítku a to z toho důvodu, že je potřeba velké množství energie pro samotnou degradaci keratinu a nezřídka v takových extrémních podmínkách dochází k likvidaci nutričně hodnotných aminokyselin jako je lysin, histidin nebo metionin za vzniku lysoalaninu, lanthothionu a dalších.

✨ 3. Enzymová degradace¶

Enzymová degradace se jeví jako rozumná alternativa k chemickým degradacím a to především z důvodu potřeby nižších teplot a také z důvodu nižší spotřeby chemikálií. Většina enzymů užívaných v pracích prášcích je modifikovaná tak, aby působila v zásaditém prostředí a o zvýšených teplotách.

Alkaláza (National center for biotechnology education, 2013) je komerčně vyráběný enzym produkovaný bakteriemi Bacillus licheniformis. Alkaláza je endo-peptidáza, která má charakter serinové proteázy mající velmi široké spektrum substrátové specifity. Její pH optimum je v rozmezí od 6,5 – 8,5 a teplotní optimum je v rozmezí od 45°C do 65 °C. Maximální aktivitu má při 60°C. Její cena je v přepočtu přibližně 350 kč za 100 ml

Savináza (National centre for biotechnolgy education, 2013) je komerčně vyráběný enzym produkovaný bakteriemi rodu Bacillus, například Bacillus lentus. Savináza je endo-peptidáza, která má charakter serinové proteázy mající velmi široké spektrum substrátové specifity. Její pH optimum je v rozmezí od 8 – 12 a teplotní optimum je v rozmezí od 20°C do 60 °C. Maximální aktivitu má při 55°C. Její cena je v přepočtu přibližně 350 kč za 100 ml

Další zajímavý enzym, který by bylo možné použít k degradaci keratinu namísto keratinázy je například Esperáza, která je produkována nejčastěji bakteriemi rodu Bacillus.

Nevýhodou použití samotné enzymové degradace je ten fakt, že keratin je příliš silně zpevněn disulfidickými můstky a bez rozbití těchto vazeb nejsou enzymy schopny v dostatečném měřítku degradovat keratin za kratší dobu a proto je potřeba surový keratin před působením enzymům předpřipravit.

✨ 4. Enzymově – chemická metoda¶

500 g peří bylo v prvním kroku povařeno 30 min při spolu s 1 litrem 0,3M NaOH za zvýšené teploty (180°C), následně byla teplota snížena a do reakční směsi bylo přidáno 1,25g alkalické proteinázy. Hydrolýza vazeb probíhala po dobu 2 hodin a poté byla proteináza inaktivovaná zvýšeným varem. Z 500 g zpracovaného peří byla po vysušení výstupem směs o šedé, práškové konzistenci s hustotou 0,332 g/cm3 a o hmotnosti 19,0001 g. Směs měla slanou chuť a charakteristický zápach (Mukesh a kol, 2012). Výsledná směs byla zanalyzována a výsledek byl porovnán s aminokyselinovým zastoupením ve zpracovaném peří, které bylo degradováno pomocí 6M HCl po dobu 24 hodin při teplotě 110°C. V následující tabulce V. je udáno zastoupení jednotlivých aminokyselin.

Tabulka V - Jednotlivé zastoupení aminokyselin před hydrolýzou a po hydrolýze. Udáno v jednotkách gAMK/kgpeří (Mukesh a kol, 2012).

Z tabulky číslo V. je patrné, že aminokyselinové zastoupení je stabilní a tudíž nedochází ke ztrátě nutriční hodnoty peří. Hlavní rozdíl je v konzistenci. Jednotlivé parametry, shrnuté v tabulce VI. byly analyzovány a porovnány. Množství vody bylo měřeno po 3 hodinách sušení při teplotě 105°C. Množství vlákna bylo měřeno pomocí extrakce v 2% H2SO4 a 2°% KOH při 100°C po dobu 15 minut. Množství vlákna bylo měřeno pomocí extrakce v etheru. Množství popelu bylo zváženo po spálení materiálu při 550 – 600 °C po dobu 3 hodin. Množství minerálů bylo analyzováno po rozložení výchozích materiálu pomocí HNO3 HClO4 Argonovou emisní spektrometrií.

Tabulka VI- Porovnání zastoupení množství komponent v surovém peří a ve zreagované a vysušené směsi Udáno v jednotkách mg AMK/ g peří (Mukesh a kol, 2012).

Z výsledku tabulky VI je patrno, že hlavní rozdíl je ve formě, v jaké se aminokyseliny vyskytují. Ve formě hydrolyzátu z peří se jeví jako velmi zajímavá alternativa pro zakrmování drůbeže z důvodu její vhodné stravitelnosti pro drůbež. Při porovnání výsledků byl nalezen nesoulad se získanými výsledky analýzy tabulky č. VI. Dle publikace od Daleva (1994) je množství surové bílkoviny 894,4 mg/g, avšak dle publikace od Kumara (2012) je množství surové bílkoviny 91 mg/g. Tento nesoulad by bylo vhodné experimentálně ověřit.

III. Použitá literatura¶

Avasn M., Aruna L., Ramakrishna R., Apta C. (2011) Degradation of feather and hair by Chrysosporium tropicum: A potent keratinophilic fungus. African Journal of Biotechnology, 10, str. 3579-3584.

Burtt E., Ichida J. (1999) Occurence of feather degrading bacilli in the plumage of birds. The Auk, 116, str. 364 - 372.

Coward-Kelly G., Chang V., Agbogbo F., Holtzapple H. (2006) Lime treatment of keratinous materials for the generation. Bioresource technology, 97, str. 1337-1347.

Dalev P. (1994). Utilization of waste feathers from poultry slaughter for production of a protein concentrate. Bioresource technology,45, str. 265 - 267.

Deivasigamani B., Alagappan, M. (2008). Industrial application of keratinase and soluble proteins from feather keratins. Journal of enviromental biology, str. 933 - 936.

Elmayergi H., Smith R. (1971). Influence of growth of Sreptomyces fradiae on pepsin-HC1 digestibility of feather meal, Journal of Microbiology, str. 1067-1072

Hill P. (2010). Some properties of keratin biomaterials: Kerateines. Biomaterials, str. 585-593.

Ichida J., Krizova L. (2001). Bacterial inoculum enhances keratin degradation and biofilm formulation in poultry compost. Journal of microbiological methods, str. 199-208.

Korniłłowicz-Kowalska T., Bohacz J. (2011). Biodegradation of keratin waste: Theory and practical aspects. Waste Management,31, str. 1689–1701.

Lin X. (1992). Purification and characterization of a keratinase from a feather degrading Bacillus licheniformis strain. Appl.Environ. Microbiol (58), str. 3271-3275.

Maruthi A. (2011). Degradation of feather and hair by Chrysosporium tropicum. A potent keratinophilic fungus. African Journal of Biotechnology,10, str. 3579 - 3584.

Mukesh K., Lavanya P.,Immaculate R.,Balakumaran D., Kalaichelvan P. (2012) Production of Feather Protein Concentrate from Feathers by In vitro Enzymatic Treatment, its Biochemical Characterization and Antioxidant. Nature, Middle-East journal of Scientific research, 11, str. 881-886.

Novoeznyme – Savinase [online]. Datum aktualizace 16. 01. 2013, :[ 16. 01. 2013] Dostupné z http://www.ncbe.reading.ac.uk/ncbe/materials/enzymes/savinase.html)

Onifade A., Al-Sane N., Al-Musallam A., Al Zarban S (1998) Review: Potentials for biotechnological applications of jeratin-degrading microorganisms and their enzymes for nutritional improvement of feathers and other keratins as livestock feed resources. Bioresource technology, 66, str. 1-11.

Patent č. 5186961: method and composition for maintainning animals on a keratin-containing diet, 1993-02-16.

Protease - novoenzyme Alcalase [online]. Datum aktualizace 16. 01. 2013, :[ 16. 01. 2013] Dostupné z http://www.ncbe.reading.ac.uk/ncbe/materials/enzymes/alcalase.html

Rogers G., Kemp J. (1972) Differentiation of Avian Keratinocytes. Characterization and relationships of the Keratin proteins of adult embrionic feathers and scales. Biochemistry, 11, str. 969-975.

Seo S., Jung B., Lee M., Paik K. (2009) The Effect of Dietary Supplementation of Feather Meal on the Performance and Muscular Taurine Contents in Growing-finishing pigs, Asian-Aust. J. Anim. Sci., 22, str. 1407 – 1413

Sharma, Mu., Sharma Me., Rao V. (2011) In vitro biodegradation of keratin by dermatophytes and some soil keratinophiles. African Journal of Biochemistry Research, 5, str. 1 - 6.

Schor R., Krimm S. (1961). Studies on the structure of feather keratin. Biophysical Journal, 1, str. 489-515.

Wrześniewska-Tosik R., Janusz A. (2007) Biocomposites with a content of keratin from chicken feathers. fibres & textiles in Eastern Europe,15, str. 106-112.

Xing Z. (2011) Keratin Nanofibers as a Biomaterial. International Conference on Nanotechnology and Biosensors, (stránky 120 - 124). Singapore.